Metodele PCR utilizate pentru determinarile de biologie moleculara

Reactia de polimerizare in lant PCR (polimerase chain reaction) are la baza o tehnologie in vitro care imita capacitatea naturala de replicare a ADN si care consta  in generarea rapida a unor copii multiple a unei secvente nucleotidice tinta (ADN sau ARN) dintr-o gena de interes sau un patogen specific; produsul amplificat PCR este apoi detectat prin diverse metode. Numarul de copii ale secventei tinta creste exponential cu fiecare ciclu de amplificare, deoarece fiecare secventa nucleotidica nou sintetizata constituie o matrita pentru o noua copie. Produsul PCR care reprezinta o copie a ADN/ARN tinta original este denumit amplicon. Aceasta metoda permite detectarea cu specificitate foarte mare a unor concentratii foarte scazute ale secventei tinta.
Amplificarea se realizeaza intr-un analizor special (thermal cycler), iar amestecul de reactie trebuie sa contina urmatoarele elemente:
- ADN sau ARN tinta: extras din proba in cursul etapei de prelucrare;
- enzima care faciliteaza sinteza lantului complementar de acid nucleic: ADN polimeraza Taq (izolata din Thermophilus aquaticus) pentru o tinta ADN sau RTth ADN polimeraza – pentru o tinta ARN - care are activitate atat de revers-transcriptaza, cat si de ADN polimeraza (permite realizarea in acelasi amestec de reactie, atat a transcrierii inverse a ARN tinta in ADN complementar - ADNc-  cat si amplificarea ADNc);
- cofactori enzimatici: Mg²⁺ si/sau Mn²⁺;
- primeri (P1 si P2): secvente scurte, monocatenare, cu lungimea maxima 20-30 nucleotide, care se leaga de o matrita monocatenara prin imperecherea complementara a bazelor; servesc ca punct de plecare pentru sinteza lantului complementar cu ajutorul ADN polimerazei, marcand inceputul si sfarsitul regiunii care trebuie sa fie amplificata;
- deoxinucleotidele (dATP, dGTP, dCTP si dUTP): folosite pentru sinteza noii catene ADN prin atasarea lor la capatul primerilor, complementar cu matrita (observatie: ampliconul va contine deoxiuridina in loc de o deoxitimidina, deosebindu-l de ADN nativ);
- amperaza: enzima care promoveaza amplificarea selectiva a tintei si distrugerea produsilor de contaminare din cursul reactiilor de amplificare anterioare; catalizeaza clivarea ADN-ului care contine deoxiuridina la inceputul primului ciclu de amplificare si nu degradeaza ADN-ul sau ARN-ul tinta.

Reactia PCR se desfasoara in 3 etape:
1. Denaturarea: in urma incalzirii amestecului de reactie la 94ºC, ADN-ul tinta este separat (denaturat) in 2 catene;
2. Hibridizarea primerilor: ca urmare a scaderii temperaturii la 55-70ºC, primerii se vor atasa complementar la capetele 3’ ale celor 2 catene;
3. Elongatia: la temperatura de 72ºC, ADN polimeraza termostabila in prezenta Mn²⁺ si a excesului de deoxinucleotid-trifosfati (deoxiadenozina, deoxiguanozina, deoxicitidina si deoxiuridina) va extinde primerii atasati in lungul matritei tinta si va produce un amplicon ADN. Analizorul va repeta automat acest proces pentru un numar stabilit de cicluri (de obicei 30-35), la fiecare ciclu dublandu-se cantitatea de amplicon ADN.


La randul sau, procesul global de amplificare desfasurat de-a lungul unui numar definit de cicluri poate fi divizat in 3 faze:
- Exponentiala: la fiecare ciclu se dubleaza cantitatea de amplicon ADN (se admite o eficienta de 100% a reactiei);
- Lineara: pe masura ce componentele reactiei sunt consumate, se produce o incetinire a reactiei iar produsii PCR incep sa se degradeze;
- Platou (end-point): reactia este stopata, nu se mai formeaza alti produsi de amplificare, iar daca faza se prelungeste mult produsii PCR vor suferi o degradare importanta.

Metodele PCR traditionale (conventionale) au la baza o detectie a produsilor PCR in faza de platou a procesului (detectie end-point). In ultimii ani, tehnologia PCR a fost revolutionata prin dezvoltarea metodelor de detectie in faza exponentiala (detectie in timp real: real-time PCR).
Tehnologia real-time PCR prezinta numeroase avantaje fata de cea conventionala: - acuratete mai mare a rezultatelor obtinute (efectuarea detectiei se realizeaza in faza precoce a reactiei, respectiv in faza de crestere exponentiala a amplificarii, cand se produce o dublare exacta a cantitatii de amplicon la fiecare ciclu; detectia in acest moment este optima in sensul ca rezultatele se coreleaza mai bine cu nivelul initial al tintei, comparativ cu tehnica PCR conventional, unde detectia are loc in faza  de platou, dupa ce reactia a fost stopata iar produsii au inceput sa se degradeze;
- domeniu de linearitate mult extins (sunt necesare mai putine dilutii ale probelor);
- limita inferioara de detectie mult imbunatatita (se pot detecta cantitati mai mici ale ADN-ului tinta, avantaj esential, spre exemplu, in evaluarea raspunsului virusologic sustinut la pacientii cu hepatita cronica cu virus C.



In laboratorul Synevo cele 2 tipuri de metode PCR se aplica la efectuarea urmatoarelor teste:
- Real-time PCR: determinarea cantitativa a viremiei la pacientii infectati cu virusurile hepatice B sau C; analiza mutatiei factorului V Leiden si a mutatei protrombinei;
- PCR conventional: detectia calitativa a tipurilor oncogene ale  virusului papilomatozei umane (HPV).

Determinarea cantitativa a viremiei - vom descrie in acest document etapa de determinare a incarcaturii virale B, cu mentiunea ca recent in laboratorul nostru s-a trecut de la tehnologia conventionala PCR la tehnologia real-time PCR Taqman cu prelucrarea automata a probelor. Particularitatea o constituie metoda de detectie a produsului PCR, care este cuantificat in cursul desfasurarii reactiei (‘in timp real”) prin monitorizarea fluorescentei emise la fiecare ciclu de amplificare, spre deosebire de detectia colorimetrica care avea loc la sfarsitul reactiei, in tehnologia conventionala.
Testele de determinare a viremiei VHB se bazeaza pe 2 procese majore:
- pregatirea probei pentru a izola ADN-VHB;
- amplificarea PCR a ADN-ului tinta cu detectia simultana a sondei oligonucleotidice dublu marcate clivate specifice tintei.
Cuantificarea viremiei se realizeaza cu ajutorul unei secvente ADN neinfectioase denumita Quantitation Standard (QS). ADN QS cu un numar cunoscut de copii este adaugat in fiecare proba si parcurge aceleasi etape de preparare a probei, amplificare PCR si detectie, ca si secventa tinta. QS contine secvente VHB cu zone identice de legare a primerilor ca si ADN-ul tinta, dar cu o zona unica de legare a sondei de detectie care permite diferentierea ampliconului QS de ampliconul tintei. Analizorul calculeaza concentratia ADN-VHB prin comparararea semnalului tintei cu semnalul QS din fiecare proba si controale.
Extractia acizilor nucleici se face automat printr-o tehnica de captura la suprafata unor bilute magnetice de sticla. Particulele virale sunt lizate prin incubarea la temperatura ridicata cu o proteaza si un tampon care elibereaza acizii nucleici si ii protejeaza de actiunea DNA-zelor din plasma. In fiecare proba este introdus ADN QS intr-o concentratie cunoscuta, impreuna cu proteaza, agentul lizant si bilutele de sticla. Dupa ce are loc incubarea amestecului, ADN VHB si ADN VHB QS vor fi captati la suprafata bilutelor de sticla, in timp ce substantele nelegate vor fi indepartate printr-un proces de spalare. Dupa incheierea etapei de spalare, acizii nucleici adsorbiti vor fi eluati cu o solutie apoasa la temperatura inalta. Proba procesata, ce include bilutele de sticla  impreuna cu ADN VHB si ADN VHB QS, va fi adaugata amestecului de amplificare si transferata in analizorul in care vor avea loc amplificarea si detectia. In cazul tehnologiei real-time PCR, amplificarea se face in prezenta unui sistem raportor care emite fluorescenta. Detectia se realizeaza cu ajutorul sondelor de tip 5’ nucleaza-sonde TaqMan, dublu marcate: la un capat cu o substanta fluorofora (“reporter dye” R) si la celalat capat cu o molecula blocanta (“quencher dye” Q). Cat timp sonda este intacta, fluorescenta sistemului R va fi inhibata de molecula Q. In cazul in care amplificarea este eficienta, moleculele de ADN nou formate vor fixa prin hibridizare sonda TaqMan; in cursul etapei de elongatie, ADN polimeraza Taq va degrada sonda prin activitatea sa enzimatica de 5’ endonucleaza si va elibera astfel fluoroforul.


Energia emisa de fluorofor in urma excitarii in UV va fi inregistrata la sfarsitul fiecarui ciclu de amplificare, fiind proportionala cu cantitatea de ADN tinta prezenta in tub pana in momentul respectiv. Sondele HBV si HBV QS sunt marcate cu fluorofori R diferiti, permitand inregistrarea independenta a emisiilor lor. Inregistrarile sunt folosite pentru generarea unei curbe de amplificare cu 3 regiuni: o regiune de latenta in care acumularea de ADN nu atinge inca punctul limita de detectie a semnalului; o regiune de amplificare exponentiala si o regiune de platou, in care amplificarea secventei tinta inceteaza in special datorita epuizarii enzimei si inhibitiei prin cantitatea mare de ADN. Cu cat este mai mare titrul de ADN VHB din proba, cu atat mai devreme fluorescenta emisa se va ridica deasupra nivelului bazal de fluorescenta.



Deoarece cantitatea de ADN VHB QS este constanta in toate probele, fluorescenta emisa de sonda de detectie ar trebui sa fie detectata in cursul aceluiasi ciclu, in cazul tuturor probelor. In treimea inferioara a regiunii de amplificare exponentiala se stabileste o valoare prag (“assigned fluorescence level”); traversarea acestei valori marcheaza declansarea amplificarii. Pentru fiecare proba se poate determina cu exactitate ciclul de amplificare in care se inregistreaza depasirea valorii prag (Ct= critical threshold value). Cu cat valoarea Ct este mai mare, cu atat titrul ADN VHB este mai mic.



Constantele de calibrare specifice lotului de reactivi vor fi folosite impreuna cu Ct corespunzatoare ADN VHB si ADN VHB QS pentru calcularea titrului ADN VHB din probe si controale.

In cazul determinarii ARN viral hepatita C, procesul se desfasoara intr-un mod similar, dar se adauga si etapa de transcriere inversa a ARN-ului tinta pentru a genera ADN-ul complementar (ADNc). Aceasta etapa este realizata tot de ADN polimeraza, ceea ce permite ca atat transcrierea inversa cat si amplificarea PCR sa se produca impreuna cu detectia in timp real a ampliconului.

Analiza mutatiei factorului V Leiden
Metoda permite detectarea si genotiparea unei mutatii punctiforme a genei umane care codifica factorul V. Prin intermediul unor primeri specifici se asigura amplificarea unui fragment ADN tinta din gena factorului V, izolat printr-o tehnica automata dintr-o proba de sange integral.
Pentru efectuarea testului se utilizeaza sistemul PCR LightCycler care foloseste o detectie in timp real prin fluorescenta a produsului amplificat diferita de cea obtinuta cu ajutorul sondei TaqMan. Astfel, pentru detectia ampliconului se folosesc 2 sonde care hibridizeaza la o secventa interna a fragmentului amplificat, in cursul fazei de hibridizare a primerilor. Sondele sunt reprezentate de 2 secvente oligonucleotidice specifice, marcate cu fluorofori diferiti:
- sonda 1, marcata la capatul 3’ cu fluoresceina (fluoroforul donator D);
- sonda 2, marcata la capatul 5’ cu substanta LightCycler Red 640 (fluoroforul acceptor A). Secventele celor 2 sonde sunt astfel selectate incat sa hibridizeze la secventele tintei intr-un aranjament de tip cap-coada, facilitand apropierea celor 2 fluorofori. Fluoresceina este excitata de lumina albastra emisa de o sursa a LightCycler-ului si emite o lumina fluorescenta verde. Ca urmare a apropierii celor 2 fluorofori in cursul fazei de hibridizare, energia emisa excita la randul sau fluoroforul Red 640, printr-un transfer de energie a rezonantei fluorescente (FRET: fluorescence resonance energy transfer); acesta va emite o lumina fluorescenta rosie, a carei intensitate va fi masurata in unitatea optica a LightCycler-ului. Cantitatea de fluorescenta emisa va fi proportionala cu nivelul tintei.



Sondele de hibridizare sunt de asemenea folosite pentru stabilirea genotipului mutatiei, prin analiza curbei de topire efectuata dupa incheierea ciclurilor de amplificare, cand ampliconul este prezent in concentratii crescute.
Sonda marcata cu Red 640 hibridizeaza la o secventa a tintei care nu contine situsul mutatiei (sonda ancora); sonda marcata cu fluoresceina hibridizeaza la o secventa care include situsul respectiv (sonda a mutatiei). In cursul analizei curbei de topire, cresterea semnificativa a temperaturii induce scaderea fluorescentei emise, deoarece sonda cu o secventa mai scurta (sonda mutatiei) este prima care disociaza si cei 2 fluorofori nu mai sunt in apropiere. Daca este prezenta mutatia factorului V, nepotrivirea sondei mutatiei cu tinta va destabiliza hibridul, astfel ca scaderea fluorescentei se va inregistra la temperaturi mai joase. In prezenta genotipului salbatic (fara mutatie), heteroduplexul ADN este stabil si va avea o temperatura de topire mai mare. Genotipul heterozigot prezinta o combinatie distincta de proprietati.
Rezultatul pentru ADN-ul unei probe trebuie sa prezinte intotdeauna un profil al curbei de topire pentru unul din cele 3 genotipuri: tipul homozigot salbatic (mutatie absenta), mutant homozigot sau genotip heterozigot. Daca nu se produce acest lucru, testul va fi considerat invalid si vor trebui repetate toate etapele.
In plus, pentru validarea rezultatelor se folosesc 2 controale, negativ si pozitiv, cu mentiunea ca, pentru acesta din urma trebuie sa se obtina obligatoriu un profil de genotip heterozigot.
Pentru analiza mutatiei protrombinei se foloseste o metoda similara.

Detectia tipurilor oncogene HPV
Testul include 4 procese majore:
- pregatirea probei;
- amplificarea ADN-ului tinta cu ajutorul unor primeri complementari specifici HPV;
- hibridizarea produsilor de amplificare la sonde oligonucleotidice specifice tintei;
- detectia acestora printr-o metoda colorimetrica.
Etapa de pregatire a probei consta in extractia ADN HPV din celule cervicale recoltate in mediu lichid, printr-o tehnica manuala. Amplificarea se realizeaza intr-un termocycler, iar detectia pe un analizor ELISA automat. Pentru monitorizarea acuratetii acestor 4 procese, se foloseste un control celular reprezentat de ADN-ul β-globinei umane care se va amplifica simultan cu ADN-ul tinta. Amestecul de reactie contine perechi de primeri specifici atat pentru ADN-ul provenit de la 13 tipuri HPV cu risc inalt, cat si pentru ADN-ul β-globinei. Detectia ampliconului este efectuata cu ajutorul unor sonde oligonucleotidice specifice care permit identificarea separata a ampliconului HPV si a celui corespunzator β-globinei.
Un rezultat negativ pentru o proba este validat numai daca se obtine un rezultat pozitiv pentru ADN-ul β-globinei.

Genotiparea HPV
In cazul acestui test amestecul de reactie contine primeri pentru amplificarea ADN a 37 genotipuri HPV precum si a genei β-globinei. Pentru detectie si genotipare se utilizeaza un ADN amplificat denaturat si stripuri care includ sonde oligonucleotidice dispuse liniar (sub forma de benzi) care permit identificarea independenta a genotipurilor HPV individuale.

Tehnica Dynal SSP pentru tipizarea HLA
Este aplicata in laboratorul Synevo pentru determinarea HLA-B27, marker pentru spondilita ankilopoietica.
Dynal SSP este o tehnica PCR ce utilizeaza primeri cu secventa specifica pentru tipizarea HLA. Produsul Dynal SSP consta in amestecuri de primeri, fiecare continand una sau mai multe perechi de primeri specifici, precum si o pereche de primeri de control (specifici pentru o secventa nonalelica din proba, care functioneaza ca un control intern al PCR, verificand eficienta procesului). Dynal SSP este bazat pe principiul ca un set de primeri cu o complementaritate perfecta cu proba poate fi utilizat mult mai frecvent si mai eficient decat seturile de primeri cu una sau mai multe nucleotide necomplementare la capatul 3’. Specificitatea sistemului de tipizare este parte a procesului de amplificare, iar procesarea post-amplificare este redusa la maximum. In cazul in care are loc amplificarea, identificarea alelelor tinta se face prin electroforeza in gel de agaroza.
Interpretarea rezultatelor obtinute poate fi facuta rapid cu ajutorul unui program de interpretare - Dynal SSP Tool, care furnizeaza o a doua opinie dupa interpretarea manuala, reducand astfel riscul unor erori umane.