Metode utilizate in microbiologie

Pentru probarea diagnosticului, se recomanda urmatoarele analize si investigatii:

Frotiul
Depistarea rapida a microorganismelor si studiul morfologiei necesare unui diagnostic microbiologic corect se realizeaza prin examen microscopic.
Examenul  microscopic poate fi proaspat, intre lama si lamela sau fixat si colorat. Prin frotiu se intelege material microbian (produs patologic sau cultura microbiana) etalat in strat subtire pe suprafata unei lame de microscop. Pentru efectuarea unui frotiu se folosesc lame de microscop curate si degresate care se marcheaza la una din extremitati cu numele pacientului si materialul microbian ce urmeaza a fi etalat.
Pentru fiecare produs patologic obisnuit se efectueaza 2 frotiuri (exceptie fac lichidele de punctie din care se fac 4 frotiuri), unul se coloreaza Gram (pentru evidentierea bacteriilor), iar al doilea Giemsa (pentru celularitate).
Frotiul din produs patologic poarta denumirea de examen microscopic colorat si are un rol deosebit in bacteriologia medicala. El ajuta in:
- orientarea catre un diagnostic rapid in caz de urgenta medicala (ex.meningita bacteriana);
- orientarea microbiologului in respingerea unor produse patologice necorespunzatoare (ex.saliva, in loc de sputa);
- corelarea dintre acesta si cultura, ce permite trecerea de la diagnosticul prezumtiv la diagnosticul de certitudine.
Aproape toate bacteriile cu importanta clinica pot fi detectate la examenul microscopic colorat, exceptie facand: acele bacterii care traiesc aproape exclusiv intracelular e.g. Chlamydia, cele care se gasesc in peretele celular (ex.Mycoplasma si Ureaplasma) si cele care au dimensiuni insuficiente pentru a fi vizualizate la microscop (ex.spirochetele).

Coloratiile folosite in bacteriologie sunt:

1. Coloratiile simple - utilizeaza un singur colorant si evidentiaza doar morfologia microbilor: dimensiune, forma, gruparea celulelor, prezenta capsulei. Dintre coloratiile simple, uzuala si rapida este coloratia cu albastru de metilen care coloreaza in albastru toate elementele celulare: bacterii, leucocite, celule epiteliale.
2. Coloratiile diferentiale - evidentiaza in afara caracterelor morfologice si reactiile de culoare ale microbilor.
Coloratia Gram si coloratia Ziehl-Neelsen (Z.N.) sunt cele mai utilizate in bacteriologie.Comportarea diferita a bacteriilor in coloratia Gram tine de diferentele structurale ale peretelui bacterian. Bacteriile Gram-pozitive apar colorate in violet, iar cele Gram-negative in rosu. Leucocitele si celulele epiteliale apar cu citoplasma colorata in roz si nucleul in rosu.
Coloratia Ziehl-Neelsen este folosita pentru identificarea urmatoarelor grupe de bacterii: Mycobacterium, Nocardia, Rhodococcus, Tsukamurella si oochistii de Cryptosporidium, Isopora, Sarcocystis si Cyclospora.Uzual in bacteriologie coloratia Z.N. este folosita pentru decelarea Mycobacteriilor. Acestea, spre deosebire de alte bacterii, datorita prezentei in peretele bacterian a unor substante ceroase, se coloreaza la cald cu fucsina bazica si rezista la decolorarea cu acizi minerali diluati si cu alcool. Bacilii acido-alcoolo-rezistenti apar colorati in rosu, iar bacteriile neacido-rezistente apar colorate in albastru la fel ca leucocitele si celulele tisulare, a caror citoplasma se coloreaza in albastru deschis cu nucleul albastru inchis.
In timp s-au dezvoltat numeroase modificari de la metoda originala  descrisa de Ziehl in 1882 si Neelsen in 1883, cea mai utilizata fiind cea descrisa de Kinyoun.
3. Coloratii speciale pentru structuri particulare ale unor bacterii (capsula - tus India; granulatii metacromatice - Del Vecchio, spori-verde malachit).
Controlul intern de calitate al frotiurilor este obligatoriu si se face cu martor pozitiv si negativ.In cazul coloratiei Gram folosim urmatorii martori:
- martor pozitiv: Staphylococcus aureus ATCC 25923;
- martor negativ: Escherichia coli ATCC 25922.

Cultura

Bacteriile apartinand unor specii diferite pot avea caractere microscopice asemanatoare, de aceea identificarea lor presupune si studiul caracterelor fiziologice care sunt cercetate "in vitro" pe medii de cultura.
Cultura bacteriana reprezinta rezultatul cresterii si multiplicarii bacteriilor intr-un mediu nutritiv si are ca scop:- izolarea microorganismelor patogene din prelevatele patologice;
- identificarea agentilor patogeni;
- testarea sensibilitatii la antibiotice in vederea initierii si monitorizarii terapiei antimicrobiene.

Clasificarea mediilor de cultura poate fi in functie de:
1. Tolerabilitate:
- medii uzuale, care permit cresterea unui numar mare de specii bacteriene;
- medii speciale, care permit cresterea unei game restranse de specii, uneori chiar tintit pentru o singura specie.
2. Scopul utilizarii:
- medii de imbogatire (intotdeauna lichide) pentru anumite grupe de bacterii;
- medii de izolare: uzuale, nediferentiale, diferentiale, care diferentiaza printr-un singur caracter grupe taxonomice sau tulpini;
- medii selective, care inhiba unele grupe bacteriene favorizand multiplicarea altora.
3. Identificare:- medii test - conventionale sau microtest;
- medii multitest - asociate sau combinate.
Pentru fiecare categorie de prelevate patologice se utilizeaza uzual un mediu sau un set de medii care permit izolarea bacteriilor cel mai frecvent implicate in infectiile zonei respective. Acest set de medii uzuale poate fi suplimentat cu alte medii in raport cu datele clinico-epidemiologice. Pentru izolarea germenilor patogeni din produse pluricontaminate, este obligatorie insamantarea pe medii diferentiale.
In cazul in care se apreciaza ca prelevatul contine un numar redus de germeni, se vor folosi medii lichide de imbogatire (bulion BHI pentru germeni aerobi, bulion thioglycolat cu resazurina pentru anaerobi, bulion selenit pentru coprocultura etc).

Incubarea mediilor insamantate se face tinand cont de exigentele bacteriilor suspectate:
- bacteriile aerobe se cultiva in atmosfera obisnuita;
- bacteriile carboxifile necesita incubarea in atmosfera de CO2, aceasta realizandu-se in exicator cu ajutorul unei lumanari;
- bacteriile strict anaerobe sunt cultivate cu ajutorul sistemelor Gaspak.
Majoritatea bacteriilor de interes medical cresc adecvat la 37ºC, spre deosebire de fungi a caror crestere este optima la 30ºC. Urmarirea placilor incubate se face 24 - 48 de ore pentru bacteriile obisnuite; 2-5 zile pentru fungi.

Examinarea culturilor
Aspectul culturii este dependent de specie si de compozitia mediului.
In mediu lichid cresterea poate fi: uniforma, cu depozit, granule, pelicula, inel, degajare gaz, formare de pigment. Pe mediile solide bacteriile formeaza colonii, caracterul acestora (forma, marime, suprafata, opacitate, consistenta, miros) si cantitatea in care s-au dezvoltat (+,++,+++,++++) orientand microbiologul catre diagnostic.
Un aspect important il reprezinta absenta cresterii bacteriene in cazul produselor de obicei pluricontaminate (ex. exsudat nazofaringian, coprocultura, secretie vaginala). Acest lucru sugereaza faptul ca pacientul se afla sub tratament cu antibiotic sistemic sau local (ovule, antiseptice orofaringiene).
Semnificatia clinica a unor izolate poate fi stabilita inca din primocultura, in cazul izolatelor din prelevate necontaminate (lichide de punctie) sau bacilii Gram-negativi izolati dincolo de un anumit prag in urocultura cantitativa.
In cazul culturilor monobacteriene izolate din prelevate normal sterile (hemocultura, lichide de punctie) se trece direct la identificare si antibiograma. Din culturile pluribacteriene sunt repicate colonii, apoi  sunt identificate pana la nivel de specie si este testata sensibilitatea la antibiotice.
Selectionarea acestora se face in functie de aspectul coloniei, natura prelevatului, diagnosticul clinic si rezultatele examenului microscopic colorat.

Identificarea serologica
Reactiile antigen-anticorp (aglutinare pe lama si latexaglutinare) isi gasesc aplicatia in laboratoarele Synevo in identificarea antigenica a unor izolate cu semnificatie clinica-prin confirmarea genului si speciei.
Tulpinile de E.coli care produc diaree sunt clasificate pe baza mecanismelor patogene in: E.coli enteropatogen (EPEC), E.coli enteroinvaziv (EIEC), E.coli enterotoxigen (ETEC), E.coli enterohemoragic (EHEC), E.coli enteroagregativ (EAEC).
Identificarea biochimica nu diferentiza tulpinile de E.coli patogene de cele nepatogene, de aceea se recomanda testul de serotipare.
Medicul clinician, pe baza semnelor clinice trebuie sa precizeze in biletul de trimitere serotipul pentru care trebuie testata proba pacientului.
EHEC - medicul curant recomanda coprocultura in primele cinci zile de boala. E.coli O157:H7 este cel mai frecvent serotip asociat colitei hemoragice. Izolarea EHEC O157H7 se comunica imediat medicului.
Examinarea culturilor: se repica 8 - 10 colonii lactozo-pozitive si se identifica prin teste biochimice.
Aglutinare: se testeaza cu ser anti O157 si anti H7.
Gastroenteritele sau toxiinfectiile alimentare  produse de bacteriile din genul Salmonella se datoreaza ingerarii de alimente contaminate cu aceste bacterii.
Cele mai frecvente salmonele izolate in Romania, in gastroenterite, sunt S.typhimurium, S.choleresuis, S.enteritidis, S.panama. Sansele de a izola agentul patogen in coprocultura sunt in prima saptamana de boala.
Examinare microscopica - la examenul intre lama si lamela cu albastru de metilen se observa numeroase PMN sau monocite care sunt asociate cu infectia produsa de S.typhi.
Insamantarea pe medii de imbogatire (e.g. bulion selenit de sodiu) si pe medii selective favorizeaza cresterea salmonelelor si permite diferentierea de alte specii de enterobacterii.
EPEC si  EIEC
Examinarea culturilor
: se repica 8 - 10 colonii lactozo-pozitive (nu se pot diferentia coloniile de E.coli patogene de cele nepatogene) si se identifica prin teste biochimice.
Aglutinare: cu seruri polivalente EPEC, EIEC.
Identificarea se realizeaza prin probe biochimice caracteristice urmata de aglutinare cu seruri specifice de grup si de tip.
Se cunosc pana in prezent patru grupe de Shigella: S.dysenteriae, S.flexneri, S.boydii, S.sonnei.
La noi in tara cele mai frecvente cazuri de dizenterie bacilara sunt produse de S.flexneri, intr-un procent mai redus se izoleaza S.sonnei si numai incidental S.boydii; S.dysenterie nu s-a mai izolat din 1950.
Examinarea microscopica evidentiaza  leucocite si hematii.
Identificarea:
prin teste biochimice si aglutinare cu seruri specifice anti-Shigella.
Streptococii beta-hemolitici cu importanta medicala sunt:
- Str.pyogenes (grup A) care produce faringinte, infectii cutanate, genitale, sechele poststreptococice;
- Streptococcus agalactiae (grup B) care face parte din flora normala a tractului genital la femeie, tractului respirator superior, tractului digestiv inferior; la nou nascutul infectat de la mama produce meningita, septicemie, la adult infectii cu diferite localizari, iar la femeia gravida avort si septicemie post-partum;
- Grupul C si G produc infectii asemanatoare cu Streptococul de grup A, dar mai putin frecvente.
Apartenenta la un anume serogrup se poate face prin reactii de latexaglutinare.

Antibiograma
Laboratorul de microbiologie are un rol esential in tratamentul infectiilor prin identificarea bacteriilor si testarea sensibilitatii la antibiotice.
Scopul esential  este de a ajuta decizia terapeutica.
Antibiograma este utila in:
- instituirea unui tratament tintit de catre medicul clinician;
- evidentierea acelor tulpini ce poseda enzime capabile sa inactiveze actiunea antibioticului in vivo;
- supravegherea epidemiologica a rezistentei bacteriene;
- compararea fenotipurilor de rezistenta a tulpinilor responsabile de infectii nosocomiale.

In laboratoarele Synevo, testarea sensibilitatii la antibiotice a tulpinilor cu implicatie clinica se realizeaza prin metoda difuzimetrica Kirby – Bauer.
Etapele efectuarii antibiogramei sunt standardizate: compozitia mediului, pH-ul mediului, densitatea inoculului, durata si temperatura de incubare, stabilitatea si concentratia substantei microbiene.
Interpretarea rezultatului antibiogramei respecta standardul CLSI 2006 (NCCLS) – “Clinical and Laboratory Standards Institute”.
Laboratorul detine un cititor automat de antibiograme (efectuate prin metoda difuzimetrica), care are incorporat in soft un program “expert” ce respecta acest standard, cu capacitatea de a detecta tulpinile secretoare de penicilinaza si beta lactamaza cu spectru extins, precum si alte fenotipuri de rezistenta.
Pe langa metoda clasica utilizata de toate laboratoarele, in laboratorul Synevo Bucuresti se efectueaza si antibiograma automata. Analizorul automat aflat in dotare are posibilitatea de a identifica microorganismul si de a testa sensibilitatea lui la antibiotice in cateva ore (2 - 12 ore). Durata de timp este variabila in functie de familia din care face parte germenele studiat. Tipurile de microorganisme identificate sunt multiple si cuprind atat bacterii Gram pozitive, cat si bacterii Gram negative.
Izolarea unui germene patogen in cultura pura (conditie esentiala pentru obtinerea unui rezultat corect) permite identificarea si testarea simultana a sensibilitatii la antibiotice pe acest analizor automat. Se efectueaza in prealabil un frotiu colorat Gram pentru verificarea puritatii tulpinii izolate si pentru alegerea cardurilor (bacterii Gram pozitive sau Gram negative).
Seturile de antibiotice continute de aceste carduri sunt special alese, ele cuprinzand atat  antibiotice uzuale, cat si antibiotice de ultima generatie pentru a putea institui un tratament optim pentru fiecare caz.
Interpretarea se efectueaza conform standardului CLSI 2006. Astfel, exista posibilitatea detectarii de enzime care inhiba actiunea antibioticului in vivo (ESBL, penicilinaza etc) si interpretarea automata a rezultatului antibiogramei in functie de prezenta/absenta acestor enzime.
Prin urmare, laboratorul Synevo poate efectua in urgenta identificari de germeni din diverse produse patologice si testarea sensibilitatii acestora la antibiotice (dupa obtinerea culturii pure).
Avantajele celor doua analizoare sunt acelea de comunicare corecta a sensibilitatii microorganismelor (in functie de CMI – concentratia minima inhibitorie – si fenotipuri de rezistenta), precum si de transmitere automata a datelor catre sistemul informatic, eliminand astfel posibilitatea de aparitie a erorilor datorate introducerii manuale a rezultatelor in sistem.
Controlul calitatii antibiogramelor se realizeaza cu tulpini de referinta recomandate de CLSI 2006:
- Escherichia coli ATCC 25922;
- Staphylococcus aureus ATCC 25923;
- Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853;
- Enterococcus faecalis ATCC 29212;
- Streptococcus pneumoniae ATCC 49619;
- Haemophilus influenzae ATCC 49247.

  •  

    Cere sfatul medicului

    afla raspunsurile la problemele tale

    Afla acum