Metode folosite in hematologie

Determinarea hemoleucogramei
Se realizeaza pe un analizor automat de hematologie ce permite determinarea a 21 de parametri ai hemoleucogramei - inclusiv diferentierea leucocitelor in 5 populatii - prin urmatoarele metode:
1) Focusare hidrodinamica (impedanta electrica);
2) Citometrie in flux cu laser semiconductor;
3) Masurarea cu SLS (sodium lauril sulfat) a hemoglobinei prin metoda fotometrica.

1) Metoda cu focusare hidrodinamica
Prin aceasta metoda sunt determinate numarul si dimensiunile eritrocitelor si trombocitelor. Scopul focusarii hidrodinamice este de a reduce suprapunerea si recircularea celulelor in zona de detectie. Dupa aspirare si diluare cu reactiv, particulele sunt directionate intr-un singur rand printr-o apertura si genereaza semnale electrice pulsatorii, pe baza carora se efectueaza numaratorile celulare.
2) Citometria in flux
Numarul de leucocite si formula leucocitara sunt determinate, dupa lizarea eritrocitelor, cu ajutorul citometriei in flux, care permite analizarea caracteristicelor fizice si chimice ale celulelor. Proba de sange este aspirata, diluata si colorata. Celulele sanguine trec apoi in linie, una cate una, prin centrul camerei de flux, unde raza laser emisa de semiconductor loveste celulele sanguine. Ca urmare, lumina va fi dispersata in directii diferite.
Lumina dispersata frontal si captata de o fotodioda  indica volumul celular, lumina dispersata lateral furnizeaza informatii asupra continutului celular (nucleu si granulatii), iar lumina fluorescenta laterala aduce informatii despre cantitatea de ADN si ARN celular. Lumina dispersata lateral si cea fluorescenta laterala sunt receptate de un tub fotomultiplicator.
In final, analizorul va afisa doua scatergrame bidimensionale:
- pe scatergrama 4DIFF (axa x reprezinta intensitatea luminii laterale, iar axa y intensitatea fluorescentei laterale) apar cele 5 populatii leucocitare si grupul de umbre eritrocitare;
- pe scatergrama WBC/BASO (axa x reprezinta intensitatea luminii laterale, iar axa y intensitatea luminii frontale) apar populatia de bazofile si restul populatiei de leucocite, precum si grupul de umbre eritrocitare.
3) SLS - Hemoglobina
Analizorul determina direct concentratia hemoglobinei cu ajutorul surfactantului Sodiu-Lauril-Sulfat (SLS). Reactia chimica include urmatoarele etape: hemoliza eritrocitelor, alterarea conformatiei moleculei de globina, oxidarea fierului si formarea SLS-Hb care este masurata fotometric.
Metoda nu este toxica, iar viteza de conversie a hemoglobinei este mare. Metoda se poate utiliza si pentru masurarea methemoglobinei, deci si a sangelui de control ce contine methemoglobina.

Parametrii analizati sunt urmatorii:
a) eritrocitari:
- numarul de eritrocite;
- hemoglobina (Hb);
- hematocritul (Ht);
- indicii eritrocitari - volumul eritrocitar mediu (VEM), hemoglobina eritrocitara medie (HEM), concentratia medie a hemoglobinei(RDW), largimea distributiei eritrocitare (RDW);
b) leucocitari:
- numarul total de leucocite
- formula leucocitara in valori relative (%) si absolute (#)
c) trombocitari:
- numarul de trombocite;
- trombocitocritul (PTC);
- volumul trombocitar mediu (VTM);
- largimea distributiei trombocitare (PDW).

Dintre acestia, analizorul masoara direct numarul de leucocite si formula leucocitara, numarul de eritrocite, hemoglobina, hematocritul si numarul de trombocite.
In afara parametrilor hemoleucogramei  si a celor doua scatergrame, analizorul mai  afiseaza si doua histograme pentru eritrocite si trombocite, ce indica numarul de celule si distributia acestora in functie de volum.
De asemenea analizorul poate detecta celulele anormale sau imature afisand diferite mesaje de avertizare generate de localizarea anormala a populatilor celulare pe scatergramele WBC/BASO sau 4DIFF, cum ar fi:
I. Leucocite: Avertizari si parametrii cheie (in paranteza):
- Modificari anormale - neutropenie (neut#, neut%), neutrofilie (neut#, neut%), limfopenie (limf#, limf%), limfocitoza (limf#, limf%), monocitoza (mono#, mono%), eozinofilie (eo#, eo%), bazofilie (ba#, ba%), leucopenie (le#), leucocitoza (le#). Valorile limita sunt in functie de valorile normale corespunzatoare varstei pacientului.
- Suspect - blasti?, granulocite imature?, deviere la stanga?, limfocite atipice?, precursori eritrocitari nucleati? Sunt detectati prin citometrie in flux sub forma unor populatii aparte ce apar pe citogramele WBC/BASO sau DIFF.
II. Eritrocite: Avertizari si parametrii cheie (in paranteza):
- Modificari anormale - dimorfism eritrocitar (histograma), anizocitoza (RDW-SD, RDW-CV), microcitoza (VEM), macrocitoza (VEM), hipocromie (CHEM), anemie (Hb), eritrocitoza (Nr. eritrocite). Ca metoda de detectie este folosita histograma pentru eritrocite, valorile limita fiind calculate in functie de valorile normale corespunzatoare varstei pacientului.
- Suspect - aglutinare eitrocitara? (Nr eritrocite, CHEM, HEM), turbiditate/interferenta cu determinarea Hb? (CHEM), deficit de Fe? (CHEM, VEM, RDW-CV), defect de Hb? (RDW-CV, VEM), fragmente eritrocitare?
III. Trombocite: Avertizari si parametrii cheie (in paranteza):
- Modificari anormale - trombocitopenie (Nr. trombocite), trombocitoza (Nr. trombocite).
- Suspect - aglutinate trombocitare? Valorile limita este calculata in functie de valorile normale corespunzatoare varstei pacientului.

Determinarea reticulocitelor
1. Metoda manuala - numarare microscopica: sangele se amesteca cu un colorant supravital (albastru cresil briliant/albastru de metilen) in proportie de 1:1, apoi se prepara frotiuri care se examineaza microscopic cu obiectivul de 100x cu imersie; se numara celulele care contin un precipitat albastru, granulo-filamentos sau sub forma de retea (cel putin doua granulatii/celula) din 1000 de eritrocite. Reticulocitele se calculeaza procentual dupa formula: Rt%= (Nr. Rt x 100)/1000 Er.
2. Numararea automata: analizor automat pe principiul citometriei in flux cu fluorescenta si LASER semiconductor.
Parametri analizati sunt :
- procentul de reticulocite - Ret%;
- numarul absolut de reticulocite - Ret#;
- pentru anumite analizoare: fractia de reticulocite imature (IRF).
Principiul metodei: Proba de sange este aspirata, diluata si colorata; se foloseste o coloratie supravitala ce precipita nucleoproteinele reziduale din eritrocitele imature. In continuare proba ajunge in sistemul optic de detectie, unde este analizata prin citometrie in flux cu laser semiconductor. Este efectuata o scatergrama, axa x reprezentand intensitatea fluorescentei laterale, iar axa y lumina dispersata frontal si sunt proiectate trei grupuri: grupul de eritrocite mature, grupul de reticulocite si grupul de trombocite, iar reticulocitele sunt calculate dupa formulele:
Rt%=(Particulele din zona de Rt x 100)/(Particulele din zona de Er mature+particulele din zona de Rt) si Rt#=(Rt% x nr de Er)/100
In cazul analizoarelor care determina suplimentar fractia reticulocitelor imature, scatergrama este impartita pe baza intensitatii luminii fluorescente in 3 zone reticulocitare (cu fluorescenta scazuta, medie si inalta) si este calculat procentul de reticulocite din fiecare zona raportat la numarul total. In final, se calculeaza fractia de reticulocite imature (IRF), reprezentand suma reticulocitelor cu fluorescenta medie si inalta.

Determinarea VSH
1. Metoda manuala Westergren: se aseaza tubul in pozitie verticala intr-un suport gradat milimetric si se citeste nivelul de sedimentare a hematiilor in mm dupa 1 ora; in unele teste este citit rezultatul si dupa un interval de 2 ore, dar acesta nu furnizeaza informatii suplimentare.
2. Metoda automata: Se realizeaza pe un analizor automat, controlat de un microprocesor, ce masoara viteza de sedimentare a hematiilor VSH cu ajutorul unui sistem de raze infrarosii. Pot fi masurate simultan intre 40 si 160 de probe pe ora, in functie de numarul de module folosite.
Sedimentarea are loc la temperatura camerei, sub influenta gravitatiei, rezultatele fiind exprimate in mm/h sau mm/2h, conform metodei Westergren. Pentru ca rezultatele sa fie reproductibile trebuie ca inaltimea coloanei de sange din tuburile de recoltare sa nu fie mai mica de 5-15 mm fata de nivelul maxim de umplere a tubului.

Determinarea testelor de hemostaza si a testelor pentru trombofilie
Se realizeaza pe un analizor automat  al carui principiu de functionare este cel coagulometric pentru testele de hemostaza si proteina S si colorimetric - pentru antitrombina III si proteina C.
Masurarea timpilor de coagulare se face pe baza cresterii vascozitatii plasmei de testat. Adaugarea reactivului declansator activeaza coagularea. Ca urmare, vascozitatea plasmei creste, influentand miscarea de pendulare a bilei metalice din cuveta de reactie. Pe masura ce vascozitatea creste, amplitudinea oscilatiilor bilei metalice scade. Aceasta amplitudine este convertita printr-un algoritm de calcul in timp de coagulare.
Miscarea constanta de pendulare a bilei metalice este imprimata de un camp electromagnetic alternativ aplicat asupra cuvetei. Energia campului electromagnetic variaza in functie de testul ce urmeaza a fi efectuat.
Calibrarea: se face cu plasma de calibrare comerciala, la fiecare schimbare a lotului de reactivi. Se obtine curba de calibrare ce coreleaza valorile exprimate in secunde cu cele procentuale corespunzatoare (pentru timpul Quick) sau cu cele cantitative (pentru fibrinogen). Pentru controlul intern de calitate se folosesc trei plasme de control  – o plasma cu valori normale si doua cu valori patologice - asigurand astfel monitorizarea zilnica a preciziei si acuratetei determinarilor. Pentru testele colorimetrice metoda de detectie este cea spectrofotometrica, ce consta in masurarea absorbantei unei lumini monocromatice (cu lungimea de unda de 405 sau 540 nm ) ce strabate cuveta in care are loc reactia de formare a substantei cromofore. Valoarea absorbantei este direct proportionala cu nivelul de antitrombina III sau proteina C prezent in plasma de testat.