Metode automate de determinare a markerilor imunologici

Paleta larga de markeri endocrini, tumorali, infectiosi, cardiaci, ososi, alergologici si de autoimunitate efectuati in laboratoarele Synevo se determina prin metode automate care au la baza reactia antigen-anticorp, metode denumite imunochimice (echivalentul termenului “immunoassay” din literatura engleza de specialitate).
Recunoasterea specifica dintre Ag si Ac caracteristica testelor imune a devenit larg utilizata ca metoda analitica. Testele imunochimice pot fi utilizate fie pentru determinarea antigenelor, fie a anticorpilor. Sensibilitatea testelor imunologice a crescut prin dezvoltarea unor noi tipuri de sisteme de detectie a semnalului si tehnologiei cu faza solida, astfel incat ele pot detecta <0.1 pg/mL de Ag prezent in sange. Ele pot fi aplicate pentru detectia de molecule mici (haptene), dar si a unor complexe proteice macromoleculare, ca si pentru Ac fata de alergeni, agenti infectiosi sau Ag autologe.
Principala caracteristica a testelor imunochimice consta in marcarea Ag sau a Ac cu o substanta care genereaza un semnal ce poate fi masurat, facilitand astfel detectia complexului Ag-Ac. In functie de tipul acestei substante testele imunochimice sunt clasificate astfel:
-  teste radioimunologice (RIA): utilizeaza marcarea cu radioizotopi (¹²⁵I, ¹³¹I, ³H, ¹⁴C, ³²P);
-  teste imunoenzimatice (EIA): utilizeaza marcarea cu enzime;
- teste imunochimice cu detectie prin fluorescenta (FIA): utilizeaza marcarea cu molecule fluorescente (fluorocromi);
- teste imunochimice cu detectie prin chemiluminiscenta (CLIA): utilizeaza pentru marcare molecule care genereaza chemiluminiscenta, cum ar fi derivati de luminol, esteri acridinici, derivati de oxalat de nitrofenil. O varianta a acestora o constituie testele imunochimice cu detectie prin electrochemiluminiscenta (ECLIA) care utilizeaza pentru marcare anumiti compusi organici (complexe de ruteniu, osmiu, etc.) care genereaza lumina electrochimic.

Teste radioimunologice (RIA)
Majoritatea testelor radioimunologice actuale utilizeaza marcarea cu ¹²⁵I care asigura rapiditatea procesului de conjugare si mentinerea activitatii biologice a reactantilor. Emisia radioactiva (raze gammma pentru ¹²⁵I) poate fi masurata cu ajutorul unui scintilator gamma. Exista doua tehnici RIA principale, competitive si necompetitive, care includ etape de spalare pentru separarea fractiunii legate de faza solida de cea libera de conjugat radioactiv. Ca faza solida pot fi utilizate bile de sefaroza sau peretele interior al unor tuburi de plastic. In metoda competitiva, utilizata pentru cuantificarea unor molecule mici, cum ar fi hormoni (hormonii sunt prea mici pentru a lega mai mult decat o molecula de Ac, astfel incat ei nu pot fi detectati printr-un test care necesita legarea a mai mult decat un Ac), o cantitate cunoscuta de Ag marcat radioactiv si Ag din proba de analizat sunt mixate si reactioneaza competitiv cu o cantitate constanta de Ac legat de o faza solida. Concentratia de analit este determinata cu ajutorul unei curbe standard emisii radioactive pe minut versus logaritmul concentratiei de analit (cu cat cantitatea de Ag neradioactiv din proba este mai mare, cu atat radioactivitatea legata este mai mica).
Pentru determinarea de Ac, Ac marcati radioactiv si Ac din proba reactioneaza competitiv cu Ag fixat de faza solida. Metodele competitive necesita cantitati mai mici de Ac si Ag decat metodele tip “sandwich”.
Testele “sandwich”/radioimunometrice utilizeaza o mare cantitate de Ac (exces stoichiometric) legat de faza solida, fiind mai sensibile decat metodele competitive. Ac legat de faza solida captureaza Ag (analitul) din solutie; dupa spalare conjugatul reactioneaza cu Ag legat de faza solida si semnalul este masurat dupa indepartarea prin spalare a conjugatului liber, semnalul generat fiind proportional cu concentratia de analit.  Aceste teste necesita Ag cu mai mult de doua situsuri antigenice. Daca se utilizeaza doi Ac diferiti (care recunosc situsuri antigenice diferite), protocolul poate fi simplificat (“one step sandwich”), astfel faza solida este mixata simultan cu Ag din proba si conjugatul.
Metoda poate fi aplicata pentru detectia de Ac utilizand Ag ca faza solida si Ag marcat radioactiv.
Comparativ cu alte teste imune, RIA prezinta avantajul unei sensibilitati ridicate (~5 pg/mL), usurinta in conjugarea izotopului, detectia semnalului fara optimizare si stabilitate fata de interferente; dezavantajele sunt stabilitatea scurta a reactivului si necesitatea protectiei antiradioactive.
Desi metoda a fost folosita in perioada de inceput a laboratorului Synevo pentru determinarile imunochimice, aceasta a fost inlocuita prin tehnici noi, mai performante.

Teste imunoenzimatice
Acest tip de teste utilizeaza marcarea cu enzime, care reprezinta alternativa pentru radioizotopi. Cele mai folosite sunt testele ELISA (Enzyme-Linked Immunoabsorbent Assay), EIA si EMIT (Enzyme-Multiplied Immunoassay Technique).
Testele EIA necesita un proces secundar pentru obtinerea semnalului prin actiunea catalitica a enzimei. Ca faza solida pentru separarea conjugatului liber de cel legat se pot folosi placute cu godeuri, bile de plastic, tuburi de plastic, particule magnetice sau latex cu filtre. Utilizarea particulelor magnetice si a latexului asigura scurtarea timpului de reactie. Enzimele cel mai des folosite sunt peroxidaza din hrean, fosfataza alcalina, beta-galactozidaza, glucozoxidaza, ureaza si catalaza. In functie de substratul clivat enzimatic utilizat se disting:
- EIA colorimetrice: utilizeaza substraturi cromogene, cum ar fi ABTS (sarea diamoniu a 2,2`-azino-di (3-etil-benzotiazolin-6-sulfonat) care formeaza cu H₂O₂ sub actiunea peroxidazei culoarea verde sau p-nitrofenil fosfat care formeaza culoarea galbena sub actiunea fosfatazei alcaline. Un spectrofotometru masoara densitatea optica a cromogenului rezultat.
- EIA cu fluorescenta (FEIA): utilizeaza substraturi fluorescente, in urma reactiei enzimatice fiind generat un fluorofor, care emite lumina de o lungime de unda caracteristica in urma excitatiei sale luminoase optime. Instrumentul utilizat (fluorometru) necesita o sursa de lumina si un tub fotomultiplicator pentru detectia emisiei fluorescente. In proba de analizat pot exista substante care emit lumina fluorescenta care pot interfera cu sensibilitatea testului. Comparativ cu EIA colorimetrice testele fluorescente genereaza o intensitate a semnalului mai mare cu cel putin un ordin de marime. In laboratorul Synevo metoda FEIA este folosita pentru determinarea IgE specifice pentru diversi alergeni si a markerilor pentru afectiuni reumatismale.
- EIA cu chemiluminiscenta (CL-EIA) utilizeaza substraturi chemiluminiscente care reactioneaza cu diferitele enzime folosite pentru marcare; reactia enzimatica chemiluminiscenta genereaza lumina. Sistemele curente utilizeaza derivati de luminol cu peroxidaza si H₂O₂  (sau un alt sistem enzimatic care genereaza H₂O₂, cum ar fi glucozoxidaza sau uricaza) plus un potentiator (derivati de fenol, cum ar fi p-iodofenol), care creste emisia de lumina de pana la 2800 de ori. Reactiile oxidative ale luminolului pot prezenta numeroase interferente care cresc semnalul nespecific. Un alt sistem utilizeaza fosfataza alcalina si un derivat de adamantil dioxetan, AMPPD, care nu necesita alte molecule pentru emisia de lumina, spre deosebire de luminol care necesita compusi oxidativi. AMPPD este un substrat complet format dintr-un grup adamantil ca stabilizator al intregii molecule, o legatura dioxetan ca sursa de energie, un fosforil ester ca situs pentru clivajul enzimatic si un grup fenil pentru chemiluminiscenta. Acest nou substrat a facut posibila dezvoltarea de teste extrem de sensibile superioare testelor RIA ca sensibilitate (~0.1 pg/mL), timp si simplitate procedurala.
In laboratorul Synevo se efectueaza prin aceasta metoda urmatoarele teste: hormon de crestere, IGF-1, ACTH, calcitonina, dublu si triplu test, Helicobacter pylori IgG etc.
EIA, ca si RIA, pot fi impartite in teste competitive (cu exces de analit, care utilizeaza conjugat Ag-enzima) si necompetitive (cu reactant in exces), care includ teste “sandwich” imunometrice pentru determinarea de Ag (hormoni, markeri tumorali, agenti infectiosi, proteine plasmatice) si teste indirecte pentru determinarea de Ac (antiHCV, autoAc).
Avantajele testelor imonoenzimatice sunt reprezentate de dezvoltarea de teste sensibile prin efectul de amplificare al enzimei, reactivi relativ ieftini si stabili, lipsa riscului radioactiv; ca si dezavantaje, masurarea activitatii enzimatice poate fi mai complexa decat masurarea activitatii unor radioizotopi, iar activitatea enzimatica poate fi influentata de constituenti plasmatici.
Testele ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay): reprezinta o metoda sensibila deoarece fiecare molecula de enzima poate converti multe molecule de substrat servind ca amplificator al reactiei. Enzimele produc produsi colorati care precipita, astfel incat nu difuzeaza de la locul de formare. In laboratorul Synevo testele ELISA sunt automatizate (ex: determinarea de testosteron liber, 17-OH progesteron, Ac anti-LKM1, Ac anticardiolipinici IgG, Ac antispermatozoizi, serologie paraziti, etc.).
Ag este legat la o suprafata solida, Ac primar se leaga de Ag, iar Ac secundar marcat cu o enzima se leaga de Ac primar; enzima converteste substratul intr-un produs colorat, care formeaza un precipitat, proportional cu cantitatea de Ac din serul pacientului.
Metoda ELISA de tip “sandwich”/cu Ag capturat creste specificitatea metodei, necesitand legarea Ac la doi epitopi diferiti (reactiile incrucisate pot avea loc la unul dintre epitopi, dar este putin probabil sa aiba loc la ambii epitopi simultan). Ac monoclonal este legat la suprafata solida si leaga Ag, daca acesta este prezent in serul pacientului; materialul nelegat este spalat; un al doilea Ac marcat, care recunoaste un epitop diferit, se leaga la Ag; o noua spalare indeparteaza Ac nelegati, apoi se adauga substratul, care este convertit intr-un produs colorat, proportional cu cantitatea de Ag prezenta in serul testat.



Metoda ELISA de tip competitiv consta in urmatoarele etape: interiorul microplacii este invelit cu o concentratie atent titrata de anticorpi; Ag din proba si Ag marcat cu enzima din conjugat “concureaza” intr-o singura reactie pentru numarul limitat de situsuri de pe Ac imobilizati; dupa indepartarea conjugatului se adauga substratul cromogenic; produsul colorat rezultat in urma reactiei este invers proportional cu cantitatea de Ag din proba.



Tehnica ELFA (Enzyme-Linked Fluorescent Assay) asociaza metoda ELISA cu o citire finala a rezultatului in fluorescenta albastra. In laboratorul Synevo aceasta tehnica automatizata este folosita pentru determinarea Ac anti-Toxoplasma IgG cantitativ, anti-Citomegalovirus IgM precum si a aviditatii anticorpilor anti-Toxoplasma IgG. O mentiune speciala trebuie facuta in legatura cu testul de aviditate, care este o metoda ce permite diferentierea unei infectii recente cu Toxoplasma gondii de o infectie mai veche. Termenul “aviditate” sau “afinitate functionala” se refera la o populatie de anticorpi si defineste forta neta de legare a antigenului. Aviditatea anticorpilor IgG este scazuta in cursul infectiei primare, dar creste treptat in decurs de saptamani sau luni, ca urmare a selectarii celulelor B capabile sa produca imunoglobuline specifice. Demonstrarea prezentei anticorpilor IgG cu aviditate crescuta indica faptul ca infectia a fost dobandita in urma cu cel putin 4 luni, in timp ce obtinerea unui indice de aviditate scazuta sugereaza posibilitatea unei infectii recente.

Teste imunochimice cu detectie prin electrochemiluminiscenta se bazeaza pe utilizarea unui complex al ruteniu (II)-tris(bipiridil) [Ru(bpy)₃]²⁺ cu tripropilamina (TPA) care genereaza lumina electrochimic in legatura cu un ciclu de reactie oxido-reducator: Ru(bpy)₃²⁺ are un situs reactiv pentru conjugarea cu analitul; este utilizat un agent activator, cum ar fi N-hidroxisuccinimid (NHS), deoarece poate fi mai usor cuplat cu grupuri amino ale proteinelor, haptenelor sau acizilor nucleici, ceea ce face posibila aplicarea tehnologiei la o gama variata de analiti. Emisia de lumina este initiata electric prin aplicarea unui voltaj complexului imun (care include complexul de Ru) atasat la microparticule invelite in streptavidina. Avantajul initierii electrice a reactiei chemiluminiscente este ca intreaga reactie poate fi precis controlata. Sunt disponibile trei principii ale metodei:
- principiul “sandwich”: initial proba pacientului este mixata cu Ac cuplati cu biotina si Ac marcati cu Ru (conjugat); dupa incubarea amestecului se adauga microparticulele paramagnetice invelite in streptavidina (faza solida); dupa cea de a doua incubare amestecul de reactie este aspirat in celula de masurat, iar conjugatul liber este indepartat; in continuare se foloseste curentul electric pentru a excita ruteniul si a genera semnalul care va permite detectia complexelor Ag-Ac; cantitatea de lumina produsa este direct proportionala cu cantitatea de Ag din proba;
- principiul competitiv: initial sunt mixate specimenul de analizat si Ag cuplat cu biotina; dupa prima incubare se adauga Ac conjugati cu complexul de Ru si microparticulele paramagnetice invelite in streptavidina; Ac conjugati se cupleaza cu situsurile inca neocupate ale Ag biotinilat, iar intregul complex se leaga de microparticule prin interactiunea biotinei cu streptavidina; dupa a doua incubare amestecul de reactie este trecut in celula de masurare; complexele imune sunt imobilizate magnetic pe suprafata electrodului, iar componentele nelegate sunt indepartate prin spalare; reactia chemiluminiscenta este stimulata electric, iar cantitatea de lumina produsa este invers proportionala cu concentratia de Ag din proba;
- principiul “bridging” este similar principiului “sandwich”, dar este destinat detectiei de Ac si include Ag biotinilat si Ag marcat cu Ru.

Determinarea TG prin ECLIA de tip “sandwich” 

Determinarea anti-TG prin ECLIA de tip “competitiv”