Alte metode folosite pentru determinarea testelor imunologice si serologice

Reactii de aglutinare: celule sau particule sunt legate unele de altele prin interactiunea Ag-Ac; Ag sau Ac atasati la particule, cum ar fi eritrocite, latex sau particule metalice, reactioneaza cu analitul din proba; ca urmare a reactiei imune particulele prezinta o aglutinare semnificativa, care poate fi observata cu ochiul liber.  O haptena cu un singur situs de legare nu poate fi aglutinata decat prin legare de o faza solida. Reactiile de aglutinare sunt foarte sensibile: o cantitate mica de Ac poate aglutina o masa mare de particule. De asemenea sunt foarte rapide, avand loc in cateva minute. Datorita sensibilitatii (~5 ng/mL) si rapiditatii lor sunt larg utilizate. Aglutinarea directa/pasiva este utilizata pentru detectia de Ac cu Ag specifice; aglutinarea inversa este utilizata pentru detectia de Ag solubile dintr-o proba cu Ac corespunzatori. Reactiile de aglutinoinhibare se bazeaza pe principiul competitiv in care aglutinarea particulelor de care este legata o haptena cu o cantitate limitata de Ac este inhibata de haptena libera prezenta in specimenul de analizat.
Hemaglutinarea reprezinta aglutinarea eritrocitelor indusa de Ac. Fiind o molecula pentamerica, IgM este o hemaglutinina mai buna decat IgG.
Hemaglutinarea pasiva: utilizeaza eritrocite la care un Ag a fost legat chimic; aglutinarea evidentiaza Ac fata de Ag respectiv. Aplicatii in laboratoarele Synevo: grupajul ABO (metoda serica Simonin); TPHA (test de hemaglutinare pentru Treponema pallidum).
Hemaglutinarea pasiva inversa: utilizeaza eritrocite la care au fost legati Ac; acestea sunt aglutinate de Ag. Aplicatii in laboratoarele Synevo: reactia Waaler-Rose pentru factor reumatoid. Sensibilitatea testelor de hemaglutinare este de ~50 ng/mL pentru detectia de Ag (analit).
Aglutinarea particulelor de gelatina/alte particule sintetice utilizeaza particule speciale neantigenice care elimina problemele legate de prezenta Ac heterofili cand sunt utilizate eritrocitele ca particule; poate inlocui orice test bazat pe hemaglutinare, cu exceptia testelor care utilizeaza eritrocitele din proba de testat ca particule; asigura o detectie mai sensibila decat atunci cand sunt utilizate celulele sanguine.
Concentratia Ac poate fi determinata prin titrare: se efectuaza dilutii seriale ale serului; la fiecare dilutie succesiva concentratia Ac scade cu un factor de 2. La o anumita dilutie nu va mai exista o cantitate suficienta de Ac care sa reactioneze cu toate Ag; titrul Ac reprezinta factorul de dilutie al ultimului tub in care are loc reactia completa.
Reactia poate fi inhibata la concentratii serice crescute de Ac. Inhibitorii sunt de obicei prezenti in concentratii mici. Pe masura ce inhibitorii sunt diluati, reactia devine pozitiva. Rezultatul initial negativ este denumit “prozona”. Aplicatii in laboratoarele Synevo: RPR cantitativ.

Reactii de precipitare: complexul Ag-Ac formeaza un precipitat vizibil, care poate fi observat calitativ cu ochiul liber sau cantitativ de catre un detector. Formarea precipitatului necesita formarea de agregate moleculare mari prin legarea Ag de catre Ac. Complexele mici raman solubile. Formarea de complexe mari necesita ca atat Ag, cat si Ac sa fie multivalente. Cantitatea de precipitat depinde atat de concentratia absoluta de Ag si Ac, cat si de concentratia lor relativa. Daca Ac sau Ag sunt in exces unul fata de celalalt, se formeaza un numar mic de complexe solubile, precipitatul fiind redus cantitativ/absent si cu Ac, respectiv Ag libere in solutie. Pe masura ce cantitatile de Ac si Ag se apropie una de cealalta, incepe sa se formeze precipitatul. Raportul de concentratie la care se formeaza cantitatea maxima de precipitat si nici Ac, nici Ag nu raman in solutie reprezinta punctul de echivalenta. Alte conditii, ca temperatura, pH-ul, incarcatura ionica a mediului si afinitatea si aviditatea Ac sunt la fel de importante in formarea precipitatului imun. Sensibilitatea limitata a reactiilor de precipitare (aproximativ 10 µg/mL) reprezinta o problema majora.
Reactii de precipitare in agar
1. Dubla difuzie Ouchterlony: Ag si Ac se plaseaza in doua godeuri pe o placuta cu gel agar si difuzeaza unul spre celalalt. Concentratiile de Ag si Ac sunt maxime la nivelul celor doua godeuri si scad cu distanta spre zero, astfel incat cele doua curbe de concentratie trebuie sa se intersecteze intr-un anumit punct reprezentand punctul de echivalenta, unde are loc formarea precipitatului. Atingerea punctului de echivalenta formeaza o linie dreapta intre cele doua godeuri. Daca nu se cunoaste concentratia unuia dintre reactivi, unul sau ambii reactivi trebuie utilizati in dilutii multiple pentru a asigura ca una dintre reactii sa aiba loc in apropierea punctului de echivalenta. Astfel de reactii sunt lente (1-2 zile) si necesita concentratii mari de reactivi, de aceea in laboratorul clinic au fost in mare masura inlocuite cu metode mai rapide.
2. Imunodifuzia radiala: Ag difuzeaza in gel agar care contine Ac.
3. Imunoelectroforeza: initial se efectueaza separarea electroforetica a proteinelor serice in gel agar, apoi se plaseaza Ac intr-un santulet in agar; Ac si proteinele difuzeaza unele spre altele cu formarea de arcuri de precipitare; diferite proteine pot fi identificate cu Ac specifici. Daca Ac specifici sunt dispusi pe intreaga suprafata a gelului se va forma o banda de precipitare: imunofixare (metoda folosita in laboratorul Synevo pentru evidentierea benzilor monoclonale).

Reactia de fixare a complementului (RFC): Ag este incubat o perioada de timp cu serul de testat in prezenta complementului provenit de la cobai. Daca sunt prezenti anticorpii specifici, acestia vor reactiona cu Ag si vor forma complexe imune care vor lega complementul si ii vor bloca functia. In  absenta Ac specifici nu se vor forma complexe imune, iar complementul liber va induce liza amestecului hemolitic alcatuit din eritrocite de oaie si hemolizina monoclonala.
In cazul prezentei anticorpilor specifici rezultatele vor fi exprimate semicantitativ sub forma de titruri.
Inainte de testarea propriu-zisa, serul este decomplementat prin incubare 30 minute la 56ºC si folosit in decurs de 8 ore; in cazul in care testul se va efectua dupa o perioada mai mare de timp, serul va trebui sa fie din nou decomplementat prin incubare 10 minute la 56ºC.
In laboratorul Synevo, RFC se efectueaza pe un analizor automat si se aplica la urmatoarele teste: serologie Borrelia, Coxiella burnetii si Listeria monocytogenes. Reactivii liofilizati sunt inclusi in godeuri plasate intr-un strip, care dupa pipetarea serului va fi introdus in analizor. La fiecare rulare a probelor este folosit un ser de control.